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技术知识

色谱柱填料粒度的选择 色谱柱如何使用

发布时间:2023-01-08 11:30:01 人气:

目前,商品化的色谱填料粒度从1μm到超过30μm均有售,而目前分析分离主要用3、5和10μm填料。填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压。粒度越小,填充柱的柱效越高;然而粒度越小,柱压越大,柱压的增加限制了粒度小于3μm的填料应用。在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度,但不是*的因素。如果固定相选择是正确,但是分离度不够,那么选用更小粒度的填料是很有用的。3μm填料填充柱的柱效比相同条件下的5μm填料的柱效提高近30%;然而,3μm的色谱柱的背压却是5μm的2倍。与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱,以缩短分析时间。另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力。 色谱柱使用前的注意事项  色谱柱在使用前,应进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。  但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的(出厂测试所使用的条件是较佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。  样品的前处理  a、使用流动相溶解样品。  b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。  c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。  流动相的配制  液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点:  a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。条件进行  b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。  c、流动相的黏度要尽量小,以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降,延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。  d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器,应使用对紫外吸收较低的溶剂配制。  e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法进行。  f、在流动相配制好后,一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测,还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。  流动相流速的选择  因柱效是柱中流动相线性流速的函数,使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱,要追求较佳柱效,较好使用较佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱,流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min为佳。  当选用较佳流速时,分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时,可适当增加甲醇或乙腈的含量)。  注意:  1.由于甲醇廉价,对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。  2.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相,没有提纯的己烷不得使用。用水较好使用超纯水(电阻率大于18兆欧),去离子水及双蒸水中含有酚类杂质,有可能影响分析结果。  3.含水流动相在实验前配制,尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。应加入氮化钠,防止细菌生长。  4.流动相要求使用0.45μm滤膜过滤,除去微粒杂质。  5.使用HPLC级溶剂配制流动相,使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命,提高柱性能。   如何缓解赛默飞色谱柱频繁损坏的问题  赛默飞色谱柱具有数字通讯功能,软件与仪器的联控功能,直接鼠标点击,就可以完成各种检测。检测器传输采用三级齿轮减速结构,仪器抗震性能优越,防止运输及使用过程震动;采用高亮度OLED显示屏,优越的美观可视效果,超高的质量稳定性。内置氘灯和氘灯,内置器件无需更换即可实现波长从190-850nm转换;仪器使用原装氘灯,可手动关/开,更换氘灯时,不必调整光轴,维护简便,氘灯使用寿命长。光路系统采用优先的凹面光栅器件、结合精密定位结构和独特的散热技术,使波长精度高,偏移小和稳定时间短,的光学系统和数字过滤极大的提高了仪器的灵敏度和结果的准确性和重复性并保证了仪器的稳定可靠。人性化、便携化的软件界面,人机工程的操作平台与按键,操作便捷、快速;样品和参比能量显示便于故障的判断和排查;仪器内部安全报警与自动故障排查功能,维护方面快捷。具有波长自动校正功能,自动调零,多量程输出选择可满足各浓度分析需求。  在赛默飞色谱柱的使用中,我们会发现很多实验室会面临色谱柱频繁损坏的问题。需要来了解一下色谱柱的损坏来源于哪些方面:  泵头密封圈的磨损;进样阀转子密封圈的磨损;析出的缓冲盐;样品中的复杂易吸附基质等等;其实,在工作过程中大多数的颗粒物堵塞导致的色谱柱背压升高问题是体现在柱头堵塞。而样品的易吸附机制也可能会和柱前端的硅胶表面游离的硅醇基发生作用导致色谱柱背压升高。但是这种情况在较低的PH系统中会有所改善,因为较低的PH系统会降低硅胶表面的硅醇基发生解离。  预防措施:  1、在液相系统中加入在线过滤器  在线过滤器的内部颗粒空隙一般是0.5微米,对于UHPLC会选择0.2微米空隙的在线过滤器。这个空隙尺寸和柱头的过滤筛板尺寸接近或者略小。所以,在线过滤器能够有效的阻隔来自样品、泵头密封垫、自动进样器的转子密封垫的颗粒物,以防止柱头过滤筛板的堵塞。注意:但是对于非常低死体积的液相系统,在线过滤器的加入可能会导致系统死体积增大峰展宽变严重的问题。而对于大多数的液相系统而言,色谱图不会有太大变化。  2、在柱子前端使用保护柱  保护柱有很多种,通用型、一体式、卡套式,但是它其实是一个和分析柱固定相相同的10-20mm的小柱子。因为它具有和分析柱相同的内部填料,所以保护柱不仅可以阻隔颗粒物,还可以阻隔易吸附的样品基质组分。注意:由于保护柱中可能有大量的强保留组分,在用强溶剂清洗系统时请取下保护柱,以防止这些强保留组分被洗脱进分析柱。保护柱如果出现吸附饱和也可能会对分离效果有影响。  3、对样品进行净化处理  有一些液相的分析方法没有明确标注样品的净化,但我希望大家在做分析时都能够考虑样品的净化,常用的方案是对样品进行过滤。在实际工作中,赛默飞色谱柱的储存也会影响柱子的使用寿命。那么对于色谱柱的储存,也有以下建议:  4、使用时注意事项:  .为避免管路中的有机溶剂和气泡进入色谱柱,先用水冲洗整个色谱系统,然后才能接入凝胶柱。  .不要让有机溶剂进入柱中,否则会使填料脱水,导致柱床损坏,要小流速开启泵,不要快速加大流速,以防止压力迅猛升高而导致柱床损坏。15mm的柱子流速不要超过3ml/min。  .每次使用后务必用蒸馏水冲洗干净将含盐的流动相置换干净,若较长时间不用请按保存方法保存。  5、保存方法:  .将凝胶柱用蒸馏水冲净后充上0.02%-0.05%的叠氮钠水溶液封存,或三氯丁醇苯基汞代盐将色谱柱封闭后低温保存(温度在5℃左右)在冰箱。  .再次使用时,用蒸馏水将保护溶液冲洗掉即可使用。  .如果次日还要使用也要从系统中取下,将赛默飞色谱柱封闭后存于4~8度的冰箱中冷藏。
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